，围绕水环境保护、渔业可持续发展、微藻生物能源方面的重大战略需求，以本所典型案例，从细胞水平、分子水平等多个层面全面剖析流式细胞技术在鱼类遗传育种学、藻类生物学、淡水生态学、水环境工程学和保护生物学的应用策略与技术优势。

　　近年来，流式细胞术(Flowcytometry ,FCM ) 凭借其高通量、高灵敏度、多参数分析与富集特点，在环境科学领域的应用迅猛发展，尤其在微生物生态学、水质监测、污染物毒性评估等方面展现出独特魅力。

　　当流式分选术与单细胞组学整合，分选环境微生物单细胞进行测序，解析环境样本中特定微生物的功能。目前流式细胞术在环境领域的潜力尚未完全释放，未来需通过技术创新（如微型化、AI驱动分析）和跨学科合作（环境科学、工程、数据科学）突破瓶颈。成为环境监视测定、生态风险评估和生物修复的核心工具，助力实现更精准的“环境健康”诊断与管理。本文围绕

　　，参考国外文献与本所典型案例，从细胞水平、分子水平等多个层面全面剖析流式细胞术在鱼类遗传育种学、藻类生物学、淡水生态学、水环境工程学和保护生物学的应用策略与技术优势。

　　一、 流式细胞术在细胞分类和分选的研究流式细胞术依据前向角散射光(FSC) 和侧向角散射光(SSC)反映细胞的大小和颗粒程度，区分与分选不同细胞亚群，有助于水生生物造血干细胞生物学与相关机制的研究。

　　斑马鱼作为脊椎动物血液发育研究的遗传模型，其主要的血液谱系借助流式细胞术分离出来，并利用这些谱量化斑马鱼血液突变体的缺陷，功能分析造血突变和病变的生物学研究。

　　利用流式细胞术分离全肾骨髓的血液谱系，发现光散射特性区分不同细胞亚群，红细胞部分存在两个不同的群体，成熟的红细胞仅存在于FSC低的部分。髓单核细胞（包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞）存在于FSC高SSC高的群体中，淋巴细胞存在于FSC中间SSC低的亚群中，未成熟前体细胞存在于FSC高SSC中间的亚群中在（图1）。脾脏和外周血谱图与全肾骨髓（WKM）不同，差异在红细胞上。从脾脏和血液中分选散射光显示只包含红细胞、淋巴细胞或髓单核细胞，在任何组织中都未曾发现未成熟的前体细胞。散射群体中的细胞百分比与形态学细胞计数的结果非常接近。表明流式细胞术能够精准测量每种主要血液谱系的相对百分比。

　　红框门为成熟红细胞、蓝框门为淋巴细胞、紫框门为未成熟前体，绿框门为成熟的骨髓单核细胞。

　　同时利用流式细胞术谱系分析斑马鱼血液突变体。发现携带slc4a1突变的杂合突变体前体散射群体增加，流式分选前体部分为较多的未成熟红细胞。携带epb41突变的杂合突变体的红细胞和前体细胞百分比与野生型相似，分选前体细胞大多数细胞在表型上类似于嗜酸性红细胞（图2）。

　　（a）典型slc4a1杂合子突变体WKM的散点分布。分选的前体细胞显示未成熟红细胞元素占优势。(b)典型的ebp41纯合突变体的WKM散射谱。分选前体细胞显示几乎所有的细胞都是未成熟的红细胞。

　　水生浮游植物种类多、数量大、分布广，了解水生浮游植物的群落、数量及分布信息具有研究淡水ECO动力学重要意义。流式细胞术能够准确的通过浮游植物固有性质(细胞大小和颗粒度，色素自发荧光)或结合荧光染料，对其进行分群，并同步研究个类群的数量和生理生化变化。

　　原理：根据藻类细胞大小和色素自发荧光来区分藻类，不同藻类会含有一种或多种色素光。如叶绿素激发光465nm/发射光685nm、藻红素激发光540nm/发射光570nm、藻蓝素激发光620nm/发射光650nm。

　　利用流式细胞术快速鉴定和分类超微浮游植物（如聚球藻 Synechococcus、原绿球藻 Prochlorococcus 等，图3）并进行系列热带海洋生物膜中超微浮游植物群落研究，如16S rRNA基因测序解析群落多样性及潜在功能，同时监测与分析环境的光照、温度、营养盐的浓度与群落结构的关联性。

　　X轴藻红蛋白橙色荧光vs. Y轴叶绿色红色荧光；分别是类原绿球藻、聚球藻、超微真核生物和微型浮游生物。

　　为了探索蓝藻和浮游细菌生物量的动态变化及其对湖泊水体透明度的影响，采集滇池水样用40μm膜过滤后SYBR GreenI染色，用

　　图4  流式细胞仪BD Accuri C6 分析滇池水样中浮游细菌的生物量

　　二、流式细胞术在细胞免疫功能与免疫机制研究水生动物而言，主要研究细胞的凝集反应、吞噬活性、ROS释放，呼吸爆发等。当病菌侵入机体时，具有免疫功能的细胞通过吞噬和杀菌作用杀灭病原物质，且在吞噬杀菌过程中会发生呼吸爆发，即产生大量的还原性杀菌物质，如H

　　O2、超氧阴离子等，这一过程称为“呼吸爆发”。 采用探针有双氢诺丹明DHR123 和 DCFH2DA可检测细胞的吞噬活力和呼吸爆发水平的变化，对评价机体的免疫状况具有十分重要的意义。用此法可研究注射病原体对虹鳟(Oncorhy nchus my kiss ) 白细胞吞噬活力的影响和水体重金属离子的毒性研究中。

　　流式细胞仪的FSC和SSC检测草鱼头肾白细胞分为三群，淋巴细胞，髓样细胞亚群I和髓样细胞亚群II。在淋巴细胞和髓样细胞亚群I中都存在IgM

　　B细胞。草鱼大IgM+B细胞和小IgM+B细胞都具有吞噬能力，但其吞噬能力无明显差别(图5)。

　　没食子酸通过ppar γ介导的免疫调节和抗氧化作用在鱼肠-肝轴中起抗炎作用

　　。发现在3月龄斑马鱼中添加没食子酸抑制Mpeg-EGFP阳性细胞(主要是巨噬细胞)的炎症聚集。3月龄的斑马鱼SBMIE建模三周后，没食子酸组的巨噬细胞数量明显低于阳性对照豆粕组，甚至低于阴性对照鱼粉组(图6A、B)

　　图6  流式细胞仪检测了没食子酸对斑马鱼SBMIE（豆粕诱导肠炎）肝脏巨噬细胞的影响

　　流式细胞术作为单细胞检测的主要技术方法，实时追踪细胞的活性状态，评估细胞的物理和生物学功能。因此能建立一种高效快速的毒性评价方式。

　　阐述了水生污染物三氯生对莱茵衣藻引起毒性的Ca2+调节机制（图7）。研究之后发现三氯生早期显著改变了Ca2+的稳态，并诱导了活性氧（ROS）过量产生，最后导致氧化应激、膜完整性丧失、膜去极化、光合作用抑制以及线粒体膜去极化等变化，这一系列变化都依赖于Ca2+。

　　也证实微囊藻Ca2+和ROS的交互作用是PCD进程的重要信号分子，而小球藻PCD的信号传递依赖于线粒体膜电位改变。另外，两株藻的PCD路径均由半胱氨酸蛋白酶介导（图8）。

　　图8 微囊藻和小球藻不同时间点下程序性细胞死亡（PCD）典型特征和信号分子的机制

　　细胞内钙离子浓度对细胞许多功能如酶的活性起着最大的作用，也是重要的细胞内信使，测定细胞内钙离子的变化，对于了解细胞内信息传递,细胞凋亡等都有一定的意义。现有多种测定钙离子浓度的染料: Fura-2 、Indo-1 、Fluo-3 和Rhod-2 等，这些染料均添加了乙酸甲酯基团，如:Fluo3-AM，使其极容易通过孵育导入细胞中，被胞内酯酶分解去除乙酸甲酯基团后保留在细胞内,与钙离子结合后产生荧光。

　　水平的变化监测和Ca2+的作用小球藻中性脂质合成的信号转导的研究（图9）。

　　三、流式细胞术在水生生物细胞核DNA研究流式细胞术在水生生物的遗传育种、种群分化等方面有极其应用价值。在水生动物细胞核中，DNA 含量随着细胞增殖周期时相不同而发生明显的变化，流式细胞仪采用DNA 特异性的核酸染料PI、DAPI 和Hoechst 进行染色。因荧光分子结合DNA 的量与细胞核内DNA 含量是成正比的，可被测细胞的DNA 含量和细胞周期时相，鉴定染色体倍性或确定细胞周期长短和不同时期比率。

　　DI 的值表示相对DNA 含量，依据DI 值来判定DNA倍性，DI=1.0±0.1为二倍体，DI=1.5±0.15为三倍体，DI=2±0.2为四倍体，DI>

　　DI 的值表示相对DNA 含量，依据DI 值来判定DNA倍性，DI=1.0±0.1为二倍体，DI=1.5±0.15为三倍体，DI=2±0.2为四倍体，DI

　　四、流式细胞术在质量评价在水生动物人工繁育及品系选育、冷冻保存等研究中，需对进行质量评估，以预测其受精能力是很必要的检测的质膜完整性、顶体状态、染色质结构完整性以及线粒体功能等方面。如流式细胞术评估虹鳟鱼的新鲜与冻存的线粒体活性与质膜完整性；还可对细胞凋亡状态的分析与检测上。凋亡细胞相对正常细胞的FSC 降低而SSC 增高，而坏死细胞则是FSC 和SSC 都增高。因此，FCM 区分凋亡细胞、坏死细胞和正常细胞，常用的方法是Annexin V/PI 双染法和末端标记法( TUNEL) 。

　　G:（几乎只有1N），H:野生型精巢（含1N，4N如初级精母，其他的2N如精原细胞等），I:突变体精巢（有2N（性腺体细胞），绝大多数可能是4N）

　　五、微藻生物能源领域中的应用流式分选术可作为富集藻类研究的重要技术方法，根据藻类细胞大小、内涵物、自发光进行分类和快速富集，为后续研究奠定基础。

　　在不同时间缺氮条件下，通过Nile Red染料对某个基因的突变衣藻染色，研究突变体基因衣藻的油脂含量变化，再应用在有前景的能源微藻上如小球藻、硅藻等（图13）。

　　为了探索雨生红球藻的抗真菌功能，把雨生红球藻细胞壁的糖类与标记荧光蛋白GFP凝集素结合，通过流式细胞仪分选低荧光强度GFP的雨生红球藻，来验证具有低荧光强度的细胞具有很强抗线  流式分选低荧光蛋白GFP凝集素的雨生红球藻

　　流式细胞术在水生环境领域应用潜力需要挖掘。总体上缺乏评价水生环境流式监测生态指标的规范流化体系，未来将污染指标与生态健康指标结合起来，形成标准化流式环境水体的生态功能指标。其次影响流式在环境中的应用重要的因素是微生物种类非常之多、微小、有些含量低、杂质多，极大干扰流式细胞仪的检测精度和特异性。可充分的利用荧光探针或量子点标记技术，提升超低浓度环境污染物检测灵敏度与分辨率，开发特异性荧光标记物或纳米传感器，提升微塑料、抗生素抗性基因等新型污染物的检验测试能力。随着数据、物联网、人工智能等现代信息技术的涌现，新兴技术的深层次地融合，必将推动生态环境监视测定技术实现重大突破，为水环境监测的发展带来了巨大机遇。

　　汪艳，高级工程师，中国科学院水生生物研究所分析测试中心。2011年引进专业方面技术人才，负责管理与运行分子与细胞生物学技术平台。二十年来深耕流式细胞术，曾获BD流式技术“杰出贡献奖”和个人“卓越奖” 所个人突出学术贡献奖-技术能手奖， 院所两级公共技术服务中心-优秀个人。参与发表论文五十多篇，参与六项国家自然科学基金项目，获发明专利1项，主持院功能开发项目2项。

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