本发明涉及生物医药，具体涉及一种碱性磷酸酶底物染色液的制备方法及其应用。

　　1、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ap)是一种专一性较广的磷酸酯水解酶，可以催化所有的磷酸酶水解反应和磷酸基团的转移反应，在生物体内有很重要的生理功能。在免疫组化中，碱性磷酸酶(ap)及其底物作为显色系统已经大范围的应用。抗体偶联的碱性磷酸酶能够水解含萘酚替代物类的磷酸盐，产生不溶性的萘酚衍生物，随后与合适的重氮盐结合，在酶活性部位生成带有颜色的不溶性偶氮染料，最终使组织切片中的抗原位置呈现不同的着色。常用的底物色原为bcip/nbt(蓝色)和萘酚磷酸/重氮类化合物(红色)。

　　2、目前，免疫组化染色使用较为广泛的是过氧化物酶显色系统，如辣根过氧化物酶(hrp)。hrp常用的底物是dab(棕黄色)和aec(红色)，然而，dab是致癌剂，且判读时会受色素沉积和红细胞等因素的干扰，而aec形成的沉淀溶于酒精，因此，二者均会在应用上有所限制。碱性磷酸酶(ap)常用的底物固红溶于有机溶剂，因此，需要搭配使用水溶性封片剂，并且显色后的切片不能经过乙醇和二甲苯脱水处理，所以不利于长期保存。另外，市场上目前某些ap底物的色原和缓冲液的稀释比例太高，不适用于全自动免疫组化染色机的染色。

　　3、因此，本领域亟需开发一种碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，可形成不溶于有机溶剂的沉淀物以长期用于免疫组化染色，同时还可以适配自动化设备做染色，以提高染色效率，节省人力与时间成本。

　　1、为解决上述技术问题，本发明提供一种碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，所述制备方法包括：

　　3、s2、将底物色原溶液和底物缓冲液混合，得到所述碱性磷酸酶底物染色液；

　　4、其中，所述底物色原溶液包括新品红、盐酸溶液、亚硝酸钠、甘油、dmso、化学稳定剂和proclin300；所述底物缓冲液包括萘酚as-bi磷酸盐、tris缓冲液、二甲基甲酰胺和tween-20。

　　6、具体地，所述萘酚as-bi磷酸盐的用量为0.3g，所述tris缓冲液的浓度为21％，所述tris缓冲液的用量为50ml，所述tris缓冲液的ph为8.4，所述二甲基甲酰胺的用量为0.5ml，所述tween-20的用量为0.15ml。

　　9、具体地，所述底物色原溶液的配制方式为：将所述新品红溶解于盐酸溶液中，将混合溶液至于冰水浴中，之后在混合溶液中加入亚硝酸钠，得到悬浊液，将悬浊液固液分离去除固体之后得到所述底物色原溶液。

　　12、具体地，所述底物缓冲液的配制方式为：将萘酚as-bi磷酸盐加入tris缓冲液中，向所得的混合溶液中加入二甲基甲酰胺和tween-20，混合后得到底物缓冲液。

　　13、本发明的第二方面，提供了一种前述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法制备得到的碱性磷酸酶底物染色液在免疫组化染色中的应用，所述免疫组化染色包括手工操作的免疫组化染色和使用全自动免疫组化染色机进行的免疫组化染色。

　　15、本发明提供的制备方法，其底物色原溶液的配方经过一直在优化得到，保证了底物色原的稳定性，使得碱性磷酸酶催化底物染色液形成不溶于有机溶剂的红色偶氮沉淀物能够长期用于免疫组化染色，同时，通过调整优化底物色原溶液和底物缓冲液的使用比例，使得得到的染色液可直接应用于全自动免疫组化染色机，逐步提升了碱性磷酸酶底物染色液的适合使用的范围，解决了人工操作有可能会引起的手动误差，同时节省了人力成本和时间成本，提升了免疫组化染色的效率和准确性。

　　2.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，其特征是，所述底物色原溶液中，新品红的用量为0.091～0.91g，盐酸溶液的浓度为1.9％，盐酸溶液的用量为20～50ml，亚硝酸钠的用量为0.052～0.52g，甘油用量为10ml，dmso用量为2ml，化学稳定剂用量为40μl，proclin300用量为10μl。

　　3.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，其特征是，所述萘酚as-bi磷酸盐的用量为0.3g，所述tris缓冲液的浓度为21％，所述tris缓冲液的用量为50ml，所述tris缓冲液的ph为8.4，所述二甲基甲酰胺的用量为0.5ml，所述tween-20的用量为0.15ml。

　　4.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，其特征是，所述底物色原溶液和底物缓冲液的混合比例为1:1～1：20。

　　5.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，其特征是，所述底物色原溶液和底物缓冲液的混合比例为1:20。

　　6.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，其特征是，所述底物色原溶液的配制方式为：将所述新品红溶解于盐酸溶液中，将混合溶液至于冰水浴中，之后在混合溶液中加入亚硝酸钠，得到悬浊液，将悬浊液固液分离去除固体之后得到所述底物色原溶液。

　　7.根据权利要求6所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，其特征是，所述冰水浴为0℃冰水浴。

　　8.根据权利要求6所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，其特征是，所述冰水浴的时间是15～20分钟。

　　9.根据权利要求1所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法，所述底物缓冲液的配制方式为：将萘酚as-bi磷酸盐加入tris缓冲液中，向所得的混合溶液中加入二甲基甲酰胺和tween-20，混合后得到底物缓冲液。

　　10.根据权利要求1-9中任一项所述的碱性磷酸酶底物染色液的制备方法制备得到的碱性磷酸酶底物染色液在免疫组化染色中的应用，其特征是，所述免疫组化染色包括手工操作的免疫组化染色和使用全自动免疫组化染色机进行的免疫组化染色。

　　本发明公开了一种碱性磷酸酶底物染色液的制备方法及其应用，所述制备方法有步骤：S1、制备底物色原溶液和底物缓冲液；S2、将底物色原溶液和底物缓冲液混合，得到碱性磷酸酶底物染色液；其中，底物色原溶液包括新品红、盐酸溶液、亚硝酸钠、甘油、DMSO、化学稳定剂和Proclin300；底物缓冲液包括萘酚AS‑BI磷酸盐、Tris缓冲液、二甲基甲酰胺和Tween‑20。本发明提供的底物色原溶液保证了底物色原的稳定性，使得碱性磷酸酶催化底物染色液形成不溶于有机溶剂的红色偶氮沉淀物，能够长期用于免疫组化染色，且制得的染色液可直接应用于全自动免疫组化染色机，提升了碱性磷酸酶底物染色液的适合使用的范围，同时节省了人力成本和时间成本，提升了免疫组化染色的效率和准确性。

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